神经科学家经常研究神经元电生理学——发生在大脑内部的神经元电活动，以更好地了解特定行为以及与大脑相关的疾病（如精神分裂症、阿尔茨海默病和帕金森病）背后的过程。
细胞靶向性膜片钳是一种经验证的测量单个神经元电活动的技术，但手工操作非常困难，尤其是 体内; 它需要双光子显微镜和微操作器的同时操作，以引导移液管与完整大脑中的目标细胞接触（细胞经常随着移液管的移动而移动，因此需要多次调整移液管位置以补偿细胞移动）应用刚好足够的吸力穿透细胞膜（图1）。世界上为数不多的能够对靶细胞进行人工膜片钳的研究人员 体内 成功率约为20%。
图1所示。测量单个神经元的电活动体内用细胞靶向性膜片钳。
在麻省理工学院媒体实验室和麦戈文研究所的爱德华·博伊登的研究小组工作时，我开发了一个系统，可以自动将细胞靶向的贴片夹紧 体内，使更多的神经科学家有可能在实验室中应用这项技术。作为MATLAB实现® 应用程序，我的Imagepatcher软件处理来自双光子显微镜的图像，向四轴微操作器发送指令，并通过控制电子压力调节器和阀门施加吸力。在活体老鼠的大脑中，Imagepatcher系统的最初实现表现得与经验丰富的神经科学家一样好，成功率达到或超过了他们。
手动夹片是如何工作的
细胞靶向贴片夹持是一个多阶段过程，当移液管尖端移动到与靶细胞接触时开始（图2）。为了手动完成第一阶段，研究人员使用双光子显微镜识别目标细胞，并使用微操作器将移液管尖端移动到视野中。一只手操作显微镜，另一只手操作微操作器，研究人员逐渐将移液管尖端移近目标细胞，小心地补偿移液管尖端接近细胞膜时的细胞移动，并进行多轮显微镜聚焦和视野调整。
图2。细胞靶向贴片钳夹过程的各个阶段。ACSF =人工脑脊液;红色 =荧光细胞;绿色 =充满荧光染料的贴片移液管;光红=激光双光子成像;黑色实心箭头=移液器移动;黑色虚线箭头=单元格移动;黄色=目标细胞充满了移液管中的荧光染料。
在移液管尖端测量到的电阻突然变化证实了移液管尖端与电池接触。此时，研究人员必须迅速将焦点从显微操作器转移到注射器上。注射器的尖端通过空心管连接到移液器的背面，用于对移液器施加吸力，帮助建立 gigaseal，尖端与与移液管尖端接触的那片细胞膜之间的紧密密封; 千兆 指大于1千兆欧（1 GΩ）。然后，研究人员应用一系列吸力脉冲来实现 闯进，即细胞膜破裂，可以进入细胞内部。这个州被称为 全细胞构型它能够高质量地记录细胞的电活动。为了获得高质量的记录，研究人员必须在尽可能少的损伤细胞的情况下完成整个过程。
从MATLAB内部访问和控制实验室设备
为了自动化涉及贴片夹紧的众多手动操作，我需要MATLAB和所涉及的三个仪器之间的接口:显微镜的接口由 ScanImage提供，这是一个开源的显微镜控制软件包，由 维护Vidrio技术．我使用ScanImage对图像采集的各个方面进行控制，包括何时以及如何从显微镜中采集图像进行MATLAB处理。微操作器的接口由制造商(Sensapex)作为库提供。我使用这个库从MATLAB内以匀速控制移液管的运动。我使用国家仪器数据采集(DAQ)板和仪器控制工具箱™开发了调节器和阀门的接口。
图3。Imagepatcher设置。
实现Imagepatcher控制循环
Imagepatcher软件包括三个主要的控制循环。每个循环在MATLAB中运行。第一个控制移液管的运动，直到它的尖端接触到目标神经元，第二个施加吸力形成一个gigaseal，第三个施加吸力脉冲来实现突破。在补丁夹紧过程中，Imagepatcher软件自动运行这些控制循环。一个基于MATLAB的接口使研究人员能够管理和监控过程(图4)。
图4。Imagepatcher接口。
第一个控制回路的算法从显微镜获取图像，对其进行分析以识别细胞，计算细胞和移液管尖端之间的偏移，并向微操作器发送命令以使移液管更靠近细胞。重复这些步骤，直到移液管达到其目标，通过移液管尖端测得的电阻突然变化发出信号。
在这个循环中，我调用了图像处理函数来分析显微镜生成的图像。首先，我使用2D维纳滤波器来去除光子噪声，它在图像中以高强度散斑的形式出现。接下来，我应用阈值函数来产生分离荧光标记细胞的图像的二进制版本。然后对二进制图像执行形态操作，以确定 质心细胞的 ——细胞边界内我用移液管瞄准的点。在循环开始之前，我使用了一个类似的程序，在图像中分离移液管并识别其尖端(图5)。尖端的初始位置用于计算在循环中移液管运动后的尖端位置。该算法在三维空间中计算出细胞质心与移液管尖端之间的偏移量后，生成移动移液管所需的微操作器指令，并通过串行接口将指令发送给微操作器。
图5。用于检测(A)目标细胞的质心和(B)移液管尖端的图像处理步骤，显示(i)原始显微镜图像，(ii)滤波图像，(iii)二值图像，(iv)二值图像与被检测特征的叠加。Red outline =单元格的轮廓;红色x =细胞质心;黄色星星=移液管尖端。
一旦移液管到达细胞，Imagepatcher就进入压力控制回路。在这里，算法通过使用MATLAB和数据采集工具箱™在移液管尖端产生压力，为设置的三个电子压力调节器产生模拟信号，为其四个电子阀门产生数字信号。该算法动态改变压力，直到在尖端测量的阻力达到1 GΩ。压力控制算法采用启发式,加快形成gigaseal-for示例中,如果测量电阻低于1 GΩ,缓慢上升,该算法显著增加吸入,而如果是稳步上升的阻力,它维护现有的压力和等待gigaseal形式。
第三个也是最后一个控制回路用于进入细胞膜。最初，Imagepatcher在获得gigaseal后自动启动这个循环，但同事们指出，一些研究人员更喜欢在闯入之前进行记录(即细胞连接的记录)。附在细胞上的记录不能提供与全细胞记录相同水平的信息(例如，阈下活动)，但一些研究需要完整细胞的记录。为了满足这一需求，Imagepatcher被配置为在继续第三个控制循环之前暂停并等待操作员确认。
为了启动侵入，Imagepatcher在压力增加的情况下应用一系列抽吸脉冲，同时再次监测移液管尖端测得的阻力。当细胞膜破裂时，测得的阻力从1%以上下降 GΩ至几百兆欧姆。当实现接入时，Imagepatcher停止抽吸，研究人员可以开始记录。
最初的结果和计划的增强
Imagepatcher的第一个版本与经验丰富的研究人员报告的成功率相匹配或略高于，实现全细胞配置的时间约为20–22%。Imagepatcher完成贴片夹紧程序所需的10分钟左右的时间与这些研究人员所需的时间相当。自动贴片夹持后的记录长度（平均约15分钟）及其质量与手动贴片夹持程序后的记录相当，表明Imagepatcher不会像手动贴片夹持程序那样损坏细胞。最重要的是，Imagepatcher提供了手动方法无法比拟的一致性和一致性，使更多的研究人员能够可靠地执行该程序。事实上，全世界已有七家实验室表示对使用Imagepatcher感兴趣。
我计划实现增强功能，通过利用硬件的能力来执行无法手动执行的技术，例如精确应用吸入脉冲模式，从而提高Imagepatcher的速度和成功率。
