在日本理研脑科学研究所，我们正在研究高度调节的哺乳动物中枢神经系统是如何建立的，以及它是如何受到环境和遗传因素的影响。作为这项研究的一部分，我们使用标准的遗传学程序培养基因突变小鼠，并研究这些小鼠的行为表型。利用这些实验数据，我们通过分析大脑区域对外部刺激(如气味、声音和光线)的反应，将特定的基因与行为联系起来。目标之一是更好地理解注意力和冲动的分子和细胞机制，并推进相关行为障碍的治疗。
为了量化大脑特定区域的活动，我们使用脑切片成像和标准酶抗体染色来检测c-Fos的表达水平，c-Fos被认为是神经活动的指标。这种染料使活性细胞变暗，使它们能够在大脑的显微图像中被识别和计数(图1)。
在分析图像时，我们遇到了神经科学和生物学实验室经常遇到的挑战:在数千张图像中检测和计数数百个点。我们的团队与MathWorks顾问合作开发了一个MATLAB®应用程序自动检测相关斑点并简化用于管理实验室中的图像数据的过程。该应用程序减少了分析单个图像所需的时间100倍，提高了实验室可以分析的样本数量，确定在手动检查期间错过的斑点，并简化了数据管理。
分析图像手动
由于实验室处理的典型图像包含300到400个点，理研所的研究人员通常要花15分钟或更多的时间分析每张图像。每个测试对象大约需要分析100幅图像，因此处理一只老鼠的图像需要几天时间。这项工作很单调，结果容易受到偏见和主观性的影响。例如，我们发现当一幅图像有很多斑点时，研究人员倾向于计算某些在斑点较少的图像中会被忽略的黑暗区域。
除了处理单个图像所需的努力外，我们的团队还花了大量时间管理和跟踪我们处理的所有图像的数据。有时，文件会暂时放错地方，而且很难跟踪需要进一步分析的图像。
为了解决这些挑战，RIKEN联系了MathWorks顾问，他们建议使用MATLAB和图像处理工具箱开发一个应用程序来自动检测和计数斑点，并帮助我们简化实验结果的数据管理工作流程。
开发识别阈值的算法
识别图像中斑点的键是对像素亮度的阈值，上面被认为是斑点的阈值。一旦建立了该阈值，它用于将原始灰度图像转换为二进制版本，其中每个光斑是完全白色的，并且背景是完全黑色的，分别表示为1和0。但是，此阈值从图像变为图像。更重要的是，用于识别阈值的最有效技术也可以从图像到图像不同。
MathWorks咨询团队实现了四种不同的算法来查找阈值。第一个使用graythresh函数来应用Otsu的方法，该方法确定一个阈值，使黑白像素的类内方差最小化。第二种算法根据全局像素密度选择阈值，使阈值每边像素的百分比是全局强度方差的函数。第三种方法与第二种方法相同，但基于局部强度方差而不是全局强度方差。第四种方法与第三种方法使用相同的方法，但增加了一个步骤来分离连接的点，使图像中许多点相互接触的地方得到更精确的计数。
图像预处理和后处理
除了为设置阈值而开发的算法外，MathWorks顾问还实现了预处理和后处理步骤，以提高整个过程的有效性。
预处理步骤包括通过调整对比度和强度来降低光晕效应，通过低通滤波器来降低噪声，并用形态运算平滑斑点边缘。用于二值图像的后处理步骤包括中值滤波和形态学操作，以区分斑点和噪声和不相关的边缘。
后处理后，blob分析对图像进行计数黑点的数量，并消除任何剩余的大的黑暗区域或背景噪声。
顾问测试了数百幅图像的预处理、阈值、后处理和blob分析操作，以改进算法和微调参数。
构建图形界面
为了使RIKEN研究人员更容易使用图像处理算法，咨询团队开发了一个基于MATLAB的接口(图2)。
在加载要处理的图像之后，我们使用界面在图像中标记感兴趣的区域(ROI)(图3)。
然后选择所需的阈值算法并调用图像处理算法。算法识别出的点被计算出来，并在屏幕上显示出来供审查。我们有时会立即使用不同的阈值方法对图像进行重新处理，然后再使用最有效的方法对特定图像产生的结果。
作为最后一步，我们指定一个MATLAB或微软®保存结果的Excel文件，包括点的个数、主题号、日期、阈值方法和使用的ROI。
加速研究
使用新的MATLAB图像处理应用程序，我们可以在几秒钟内分析一幅图像——大大少于之前需要的15分钟。在过去，我们的团队很少对整个大脑区域(大约100张图像)进行神经成像分析，因为这需要太多的时间和精力。这个分析不再需要花费几天的时间，现在使用MATLAB只需要几分钟就可以完成。同样重要的是，我们取得了更好的结果，因为检测算法识别肉眼无法检测的斑点。
有了自动化的MATLAB系统，我们在繁琐的计数任务上花费的时间大大减少，使我们能够将更多的注意力和专业知识集中在重要的研究活动上。这额外的时间，加上处理比以前更多图像的能力，导致理研所探索了几个以前没有考虑过的新研究路径，并为我们小组的研究进展做出了贡献。例如，我们现在可以筛选整个大脑区域，以找到给定刺激的ROI，比较不同组基因改变的受试者。
我们计划在类似的研究项目中使用MATLAB实现图像处理自动化，包括一个钙指示剂用于突出染色体图像中活细胞对特定刺激的反应，以及另一个涉及体内信号分析。
