神经科学家经常研究神经元电生理学 - 在大脑内发生的神经元的电活动 - 以更好地了解可能使特定行为的过程以及与大脑相关的疾病，例如精神分裂症，阿尔茨海默病和帕金森病。
细胞靶向贴片夹紧是一种用于测量单个神经元的电活动的证明技术，但手动执行是非常具有挑战性的，特别是 在活的有机体内;它需要同时操作双光子显微镜和微操纵器，以引导移液管与完整脑中的靶细胞接触（通过响应于移液管运动的电池经常移动，因此需要多次移液管位置调节以补偿细胞运动）和施加足够的抽吸突破细胞膜（图1）。少数关于世界上的研究人员，他们可以进行有针对性细胞素的手动补丁钳位，其成功率约为20％。
图1.测量单个神经元中的电活动在活的有机体内具有细胞靶向贴片夹紧。
我在麻省理工学院媒体实验室和麦戈文研究所的爱德华·博伊登研究小组工作，开发了一个自动化细胞靶向贴片夹紧的系统 在活的有机体内，使许多神经科学家可以在其实验室中应用该技术。实施为matlab® 应用程序，我的Imagepatcher软件处理来自双光子显微镜的图像，向四轴微操作器发送命令，并通过控制电子压力调节器和阀门进行抽吸。在活体小鼠大脑中，Imagepatcher系统的初始实现与经验丰富的神经科学家一样成功与他们的比率相匹配或超过他们的比率。
手动贴片夹紧的工作原理
电池靶向贴片夹紧是一种多级过程，当移液管的尖端与靶细胞接触时开始于其开始（图2）。为了手动完成这一第一阶段，研究人员使用双光子显微镜来识别目标电池和微操纵器，以将移液管尖端操纵到视野中。用一只手和微操纵器用另一只手动操作显微镜，研究人员逐渐将移液管尖端移到目标电池，仔细补偿电池运动，因为移液管尖端接近电池膜，具有多轮显微镜焦点和场- 查看调整。
图2.细胞靶向贴片夹紧过程的阶段。ACSF = 人工脑脊液；红色 = 荧光电池 = 填充荧光染料的贴片移液管；浅红色=用于双光子成像的激光；黑色实心箭头=移液管移动；黑色虚线箭头=细胞移动；黄色=填充移液管荧光染料的目标细胞。
在移液管尖端测量到的电阻突然变化证实了移液管尖端与电池接触。此时，研究人员必须迅速将焦点从显微操作器转移到注射器上。注射器的尖端通过空心管连接到移液器的背面，用于对移液器施加吸力，帮助建立 巨豹，尖端和与移液管尖端接触的细胞膜片之间的紧密密封； 千兆 refers to resistance of greater than one gigaohm (1 GΩ). The researcher then applies a series of suction pulses to achieve 闯进，细胞膜片破裂，进入细胞内部。这种状态称为 全电池配置，实现细胞电活动的高质量记录。为实现高质量录音，研究人员必须尽可能损害整个程序。
从Matlab内访问和控制实验室设备
为了使贴片夹紧过程中涉及的大量手动操作自动化，我需要在MATLAB和三个相关仪器之间建立一个接口：双光子显微镜、微操作器以及控制移液管尖端压力的电子压力调节器和阀门（图3）.显微镜的接口由提供 ScanImage是一个开源的显微镜控制软件包，由 Vidrio Technologies.我用过ScanImage控制图像采集的各个方面，包括何时以及如何从显微镜中采集图像，以便在MATLAB中进行处理。制造商（Sensapex）将微操作器的接口作为库提供。我使用该库在MATLAB中以匀速控制移液管的运动。我使用国家仪器数据采集（DAQ）板和仪器控制工具箱开发了调节器和阀门的接口™.
图3。Imagepatcher设置。
实现ImagePatcher控制循环
Imagepatcher软件包括三个主要的控制循环。每个循环在MATLAB中运行。第一个控制移液管的运动，直到它的尖端接触到目标神经元，第二个施加吸力形成一个gigaseal，第三个施加吸力脉冲来实现突破。在补丁夹紧过程中，Imagepatcher软件自动运行这些控制循环。一个基于MATLAB的接口使研究人员能够管理和监控过程(图4)。
图4。Imagepatcher接口。
第一个控制回路的算法从显微镜获取图像，分析它以识别细胞，计算细胞和移液管尖端之间的偏移量，并向微操作器发送命令将移液管移动到更靠近细胞的位置。这些步骤重复进行，直到移液管到达目标位置，在移液管尖端测量到电阻的突然变化。
在这个循环中，我调用了图像处理函数来分析显微镜生成的图像。首先，我使用2D维纳滤波器来去除光子噪声，它在图像中以高强度散斑的形式出现。接下来，我应用阈值函数来产生分离荧光标记细胞的图像的二进制版本。然后对二进制图像执行形态操作，以确定 重心 细胞边界内我用移液管瞄准的点。在循环开始之前，我使用类似的程序来分离图像中的移液管并识别其尖端（图5）。针尖的初始位置用于计算循环内移液管移动后的针尖位置。在计算细胞质心和移液管尖端之间的三维偏移后，该算法生成移动移液管所需的微操作器命令，并通过串行接口将命令发送给微操作器。
图5.用于检测（a）靶细胞的质心的图像处理步骤和（b）移液器的尖端，显示（i）原始显微镜图像，（ii）滤波图像，（iii）二进制图像，（iv）与检测到的特征的二进制图像的覆盖层。红色轮廓=细胞的轮廓;红色x =细胞的质心;黄色星=移液管的尖端。
一旦移液管到达细胞，Imagepatcher就进入压力控制回路。在这里，算法通过使用MATLAB和数据采集工具箱™在移液管尖端产生压力，为设置的三个电子压力调节器产生模拟信号，为其四个电子阀门产生数字信号。该算法动态改变压力，直到在尖端测量的阻力达到1 GΩ。压力控制算法采用启发式,加快形成gigaseal-for示例中,如果测量电阻低于1 GΩ,缓慢上升,该算法显著增加吸入,而如果是稳步上升的阻力,它维护现有的压力和等待gigaseal形式。
第三个也是最后一个控制回路用于进入细胞膜。最初，Imagepatcher在获得gigaseal后自动启动这个循环，但同事们指出，一些研究人员更喜欢在闯入之前进行记录(即细胞连接的记录)。附在细胞上的记录不能提供与全细胞记录相同水平的信息(例如，阈下活动)，但一些研究需要完整细胞的记录。为了满足这一需求，Imagepatcher被配置为在继续第三个控制循环之前暂停并等待操作员确认。
为了启动侵入，Imagepatcher在压力增加的情况下应用一系列抽吸脉冲，同时再次监测移液管尖端测得的阻力。当细胞膜破裂时，测得的阻力从1%以上下降 GΩ至几百兆欧姆。当实现接入时，Imagepatcher停止抽吸，研究人员可以开始记录。
初步结果和计划的改进
第一个版本的ImagePatcher匹配或略微超过经验丰富的研究人员报告的成功率，从而实现了大约20-22％的时间。imagePatcher完成修补程序夹紧程序的10分钟偶像与这些研究人员所需的时间相当。在自动补丁夹紧（平均约15分钟）之后进行的录音的长度与手动修补程序后的录音相当，这表明imagePatcher不会损坏该单元的任何手动补丁 -夹紧程序会。最重要的是，imagePatcher提供了不能通过手动方法匹配的均匀性和一致性，使许多研究人员能够可靠地执行该过程。事实上，全球七个实验室已经表达了使用ImagePatcher的兴趣。
我计划实施增强功能，通过利用硬件执行无法手动执行的技术（如精确应用抽吸脉冲模式）的能力，提高Imagepatcher的速度和成功率。
