用图像处理自动控制细胞神经科学实验

神经科学家经常研究神经元电生理学——发生在大脑内部的神经元电活动——以更好地理解可能导致特定行为的过程，以及与大脑相关的疾病，如精神分裂症、阿尔茨海默病和帕金森病。

细胞靶向膜片夹紧是测量单个神经元电活动的成熟技术，但手动执行极具挑战性，特别是 在活的有机体内；它需要双光子显微镜和显微操作器同时操作，引导移液管与完整大脑中的目标细胞接触(细胞经常随着移液管的移动而移动，因此需要多次调整移液管位置以补偿细胞运动)，并应用足够的吸力来突破细胞膜(图1)。世界上少数研究人员能够在体内对目标细胞 进行手动膜片钳夹 ，成功率约为20%。

我在麻省理工学院媒体实验室和麦戈文研究所的爱德华·博伊登研究小组工作，开发了一个系统，可以自动锁定细胞的补丁夹紧 在活的有机体内这使得更多的神经科学家有可能在他们的实验室中应用这项技术。由MATLAB实现^®我的Imagepatcher软件在 应用程序中处理双光子显微镜的图像，向四轴微操作器发送命令，并通过控制电子压力调节器和阀门施加吸力。在活体小鼠大脑中，Imagepatcher系统的初始实施表现与经验丰富的神经科学家一样好，成功率与他们相当或超过他们。

手动膜片夹紧如何工作

细胞靶向膜片钳夹是一个多阶段的过程，当移液管的尖端移动到与目标细胞接触时开始(图2)。为了手动完成这第一阶段，研究人员使用双光子显微镜来识别目标细胞，并使用显微操作器将移液管尖端移动到视野中。用一只手操作显微镜，用另一只手操作显微操作器，研究人员逐渐将移液管尖端移近目标细胞，当移液管尖端接近细胞膜时，小心地补偿细胞的运动，并进行多轮显微镜聚焦和视野调整。

在移液管尖端测量到的电阻的突然变化证实了移液管尖端与细胞接触。在这一点上，研究人员必须迅速将焦点从显微操作器转移到注射器上。注射器，其尖端通过空心管连接到移液管的背面，用于对移液管施加吸力，以帮助建立 gigaseal，移液管尖端与与移液管尖端接触的细胞膜贴片之间的紧密密封; giga 表示电阻大于1gigaohm(1 GΩ)。然后研究人员应用一系列吸力脉冲来实现 在即提供进入细胞内部通道的细胞膜补丁破裂。这种状态被称为 全细胞配置，可以高质量地记录细胞的电活动。为了获得高质量的记录，研究人员必须在对细胞损伤尽可能小的情况下完成整个过程。

从MATLAB中访问和控制实验室设备

为了使膜片夹紧过程中涉及的大量手工操作自动化，我需要MATLAB和涉及的三个仪器之间的接口:双光子显微镜、微操作器、电子压力调节器和控制移液器针尖压力的阀门(图3)。显微镜的接口由 ScanImage提供，这是一个由 维护的显微镜控制开源软件包Vidrio技术．我使用ScanImage控制图像采集的各个方面，包括何时以及如何从显微镜中捕获图像以在MATLAB中进行处理。微操作器的接口是由制造商(Sensapex)作为库提供的。我使用这个库从MATLAB中以均匀的速度控制移液器的运动。我使用国家仪器数据采集(DAQ)板和仪表控制工具箱™开发了调节器和阀门的接口。

实现Imagepatcher控制循环

Imagepatcher软件包括三个主要控制循环。每个循环在MATLAB中运行。第一个控制移液管的移动，直到其尖端接触目标神经元，第二个应用吸力形成千兆密封，第三个应用吸力脉冲实现侵入。在补丁夹紧过程中，Imagepatcher软件自主地运行这些控制循环。基于MATLAB的接口使研究人员能够管理和监控过程(图4)。

第一个控制回路的算法从显微镜获取图像，分析图像以识别细胞，计算细胞与移液管尖端之间的偏移，并向微操作器发送命令以将移液管移动到更接近细胞的位置。重复这些步骤，直到移液器到达目标位置为止，目标位置由移液器尖端测量到的电阻突然变化发出信号。

在这个循环中，我调用图像处理函数来分析显微镜生成的图像。首先，我使用2D维纳滤波器去除光子噪声，它在图像中表现为高强度的斑点。接下来，我应用阈值函数来生成分离荧光标记细胞的图像的二进制版本。然后，我对二值图像进行形态学操作，以确定 重心细胞的 -我用移液管瞄准的细胞边界内的点。我使用类似的程序，在循环开始之前，在图像中隔离移液器并识别其尖端(图5)。尖端的初始位置用于计算移液器在循环中移动后尖端的位置。该算法在计算细胞质心与移液器尖端之间的三维偏移量后，生成移动移液器所需的微操作器命令，并通过串行接口将命令发送给微操作器。

一旦移液管到达细胞，Imagepatcher进入压力控制回路。在这里，该算法通过使用MATLAB和数据采集工具箱™在移液器尖端产生压力，为设置的三个电子压力调节器产生模拟信号，并为其四个电子阀门产生数字信号。算法动态改变压力，直到在尖端测量的阻力达到1 GΩ。压力控制算法使用启发式来加速千兆密封的形成——例如，如果测量到的阻力远低于1 GΩ并且缓慢上升，算法会显著增加吸力，而如果阻力稳步上升，它会保持现有的压力并等待千兆密封的形成。

第三个也是最后一个控制回路用于侵入细胞膜。最初，Imagepatcher在实现gigaseal后自动启动了这个循环，但同事们指出，一些研究人员更喜欢在闯入之前进行记录(即细胞附着记录)。细胞附加记录不能提供与全细胞记录相同水平的信息(例如，亚阈值活动)，但一些研究需要完整细胞的记录。为了满足这一要求，Imagepatcher被配置为暂停并等待操作人员确认，然后再继续进行第三个控制循环。

为了开始侵入，Imagepatcher应用一系列吸力脉冲，增加压力，同时再次监测移液管尖端测量的电阻。当细胞膜破裂时，测量到的电阻从1 GΩ多下降到几百兆欧。当入侵成功时，Imagepatcher停止吸吸，研究人员可以开始记录。 

初始结果和计划的改进

第一个版本的Imagepatcher与有经验的研究人员报告的成功率相匹配或略超过，实现了大约20-22%的全细胞配置。Imagepatcher完成一个补丁夹紧程序所需的10分钟左右的时间与这些研究人员所需的时间相当。自动膜片夹紧后的录音长度(平均约15分钟)及其质量与手动膜片夹紧程序后的录音相当，这表明Imagepatcher不会比手动膜片夹紧程序对细胞的损害更大。最重要的是，Imagepatcher提供了手工方法无法比拟的一致性和一致性，使更多的研究人员能够可靠地执行程序。事实上，全球已有7个实验室表示对使用Imagepatcher感兴趣。

我计划通过利用硬件执行手工无法执行的技术的能力，例如精确应用吸入脉冲模式，来实现提高Imagepatcher的速度和成功率的增强功能。