在理研脑科学研究所用MATLAB加速神经图像分析

在理研脑科学研究所，我们正在研究高度调控的哺乳动物中枢神经系统是如何建立的，以及它是如何受到环境和遗传因素的影响。作为这项研究的一部分，我们使用标准的遗传学程序开发基因突变小鼠，并研究这些小鼠的行为表型。利用这些实验数据，我们通过分析大脑区域对气味、声音和光线等外部刺激的反应，将特定基因与行为联系起来。一个目标是更好地理解注意力和冲动背后的分子和细胞机制，并推进相关行为障碍的治疗。

为了量化大脑特定区域的活动，我们使用脑切片成像和标准酶抗体染色来检测c-Fos的表达水平，c-Fos是一种被认为是神经活动指标的蛋白质。这种染料使活性细胞变暗，使它们能够在大脑的显微镜图像中被识别和计数(图1)。

在分析图像时，我们遇到了神经科学和生物学实验室中经常出现的挑战:在数千张图像中检测和计数数百个点。我们的团队与MathWorks顾问合作开发了一个MATLAB^®自动检测相关点的应用程序，并简化了用于管理实验室图像数据的过程。该应用程序将分析单幅图像所需的时间缩短了100倍，增加了实验室可以分析的样本数量，识别了人工检查期间遗漏的点，并简化了数据管理。

手动分析图像

由于实验室处理的典型图像包含300到400个点，RIKEN的研究人员通常要花费15分钟或更长时间来分析每张图像。每个测试对象必须分析大约100张图像，因此仅处理一只老鼠的图像就需要几天时间。工作单调，结果容易受到偏见和主观性的影响。例如，我们发现，当一张图像有很多斑点时，研究人员倾向于计算某些在斑点较少的图像中会被忽略的黑暗区域。

除了处理单个图像所需的工作之外，我们的团队还花费了大量时间管理和跟踪我们处理的所有图像的数据。有时，文件会暂时放错位置，很难跟踪需要进一步分析的图像。

为了解决这些挑战，RIKEN联系了MathWorks顾问，他们建议使用MATLAB和图像处理工具箱开发一个应用程序，以自动检测和计数斑点，并帮助我们简化实验结果的数据管理工作流程。

开发识别阈值的算法

在图像中识别斑点的关键步骤是找到像素亮度的阈值，超过该阈值的任何黑暗区域都被视为斑点。一旦建立了这个阈值，它就被用来将原始灰度图像转换为二进制版本，其中每个点都是完全白色的，背景是完全黑色的，分别用1和0表示。然而，这个阈值因图像而异。更重要的是，识别阈值的最有效技术也可能因图像而异。

MathWorks咨询团队实现了四种不同的算法来查找阈值。第一个使用graythresh函数在图像处理工具箱中应用大津的方法，该方法确定了一个阈值，使黑白像素的类内方差最小化。第二种算法基于全局像素密度选择阈值，使得阈值两侧像素的百分比是全局强度方差的函数。第三种方法与第二种方法相同，但基于局部强度方差而不是全局。第四种方法使用与第三种方法相同的方法，但应用了额外的步骤来分离连接的点，在许多点相互接触的图像中给出更准确的计数。

图像预处理与后处理

除了为设置阈值而开发的算法之外，MathWorks顾问还实现了预处理和后处理步骤，以提高整个过程的有效性。

预处理步骤包括通过调整对比度和强度来降低光晕效应，通过低通滤波器来降低噪声，以及通过形态学操作来平滑斑点边缘。应用于二值图像的后处理步骤包括中值滤波和从噪声和不相关的边缘区分点的形态操作。

后处理后,blob分析在图像上执行，以计算黑点的数量，并消除任何剩余的大黑点区域或背景噪声。

顾问们在数百张图像上测试了预处理、阈值、后处理和斑点分析操作，以改进算法和微调参数。

构建图形界面

为了使RIKEN的研究人员更容易使用图像处理算法，咨询团队开发了一个基于MATLAB的接口(图2)。

加载要处理的图像后，我们使用接口在图像中标记感兴趣的区域(ROI)(图3)。

然后我们选择所需的阈值算法并调用图像处理算法。由算法识别的点被计数并在屏幕上勾勒出来以供检查。我们有时会立即使用不同的阈值方法对图像进行重新处理，然后再使用最有效的方法对特定图像产生的结果。

作为最后一步，我们指定MATLAB或Microsoft^®将结果保存在Excel文件中，其中包括点的数量，以及使用的主题号，日期，阈值方法和ROI。

加速研究

使用新的MATLAB图像处理应用程序，我们可以在几秒钟内分析图像，大大缩短了之前所需的15分钟时间。在过去，我们的团队很少对大脑的整个区域(大约100张图像)进行神经成像分析，因为这需要太多的时间和精力。这个分析现在用MATLAB在几分钟内就能完成，而不是花几天时间。同样重要的是，我们获得了更好的结果，因为检测算法识别了肉眼无法检测到的点。

有了自动化的MATLAB系统，我们在繁琐的计算任务上花费的时间大大减少，使我们能够将更多的注意力和专业知识集中在重要的研究活动上。额外的时间，加上处理更多图像的能力，使理研探索了一些以前没有考虑过的新研究路径，并促进了我们小组的研究进展。例如，我们现在可以筛选整个大脑区域，找到特定刺激的ROI，比较不同组的基因改变受试者。

我们计划在类似的研究计划中使用MATLAB实现图像处理自动化，其中包括使用钙指标来突出染色体图像中活细胞对某些刺激的响应，以及另一个涉及在活的有机体内信号分析。