自动控制与图像处理细胞神经科学实验

神经学家经常研究神经元electrophysiology-the神经元电活动发生在大脑更好地理解的过程或许构成了特定的行为和大脑相关疾病,如精神分裂症、阿尔茨海默氏症和帕金森氏症。

Cell-targeted patch-clamping是一个经过验证的技术测量个体神经元的电活动,但它极具挑战性手动执行,特别是 在活的有机体内;它需要同时操作的双光子显微镜和显微操纵器来指导一个吸管接触目标完整的大脑细胞(细胞经常移动的吸管运动,因此需要多个吸管位置调整,以弥补细胞运动)和应用程序的足够的吸突破细胞膜(图1)。世界上为数不多的研究人员可以执行手动patch-clamping体内靶向细胞  成功率约为20%。

在爱德华Boyden在麻省理工学院媒体实验室的研究小组和麦戈文研究所,我开发了一个系统,自动化cell-targeted patch-clamping 在活的有机体内,使更多的神经科学家应用技术实验室。作为一个MATLAB实现^® 应用,我Imagepatcher软件过程从双光子显微镜图像,将命令发送到四轴显微操纵器,并应用吸入通过控制电子压力调节器和阀门。活老鼠大脑,Imagepatcher系统的初始实现执行以及经验丰富的神经科学家,和成功率,达到或超过他们的。

手工Patch-Clamping是如何工作的

Cell-targeted patch-clamping是一个多级的过程当吸管的一角开始进入接触目标细胞(图2)。手动完成第一阶段,研究人员使用一个双光子显微镜来确定目标细胞显微操纵器来操纵吸管进入视野。用一只手操作显微镜和显微操纵器,研究者逐渐将吸管提示接近目标细胞,小心翼翼地补偿细胞运动当吸管提示接近细胞膜,多次显微镜聚焦和视场的调整。

突然改变电阻测量的吸管提示确认的技巧是与细胞接触。在这一点上,研究者必须迅速改变焦点从显微操纵器的注射器。的注射器,提示连接到后面的吸管通过空心管,用于吸适用于帮助建立 吸管gigaseal,之间的密封和细胞膜接触补丁的吸管提示; giga 指阻力大于1 gigaohm (1 GΩ)。研究人员然后应用一系列吸脉冲实现 在细胞膜的破裂片,提供细胞的内部。这个状态,称为 全细胞配置,使细胞的电活动的高质量的录音。实现高质量的录音,研究人员必须执行整个过程尽可能少的细胞损伤。

在MATLAB中访问和控制实验室设备

自动化patch-clamping涉及大量手工操作,我需要一个接口之间的MATLAB和三种工具:双光子显微镜、显微操纵器,和电子压力调节器和阀门控制压力在吸管提示(图3)。接口提供的显微镜是 ScanImage,开源软件包显微镜控制由 维护Vidrio技术。我使用ScanImage控制图像采集的所有方面,包括何时以及如何捕捉MATLAB显微镜进行处理的图像。显微操纵器的接口提供了一个图书馆的制造商(Sensapex)。我使用这个库控制吸管的运动以均匀的速度在MATLAB。我开发了监管机构的接口和阀门使用国家仪器数据采集板和仪器控制工具箱™(采集)。

实现Imagepatcher控制回路

Imagepatcher软件包括三个主要控制回路。每个循环都是在MATLAB中运行。第一管理吸管,直到它的头接触的运动神经元,第二吸适用于形成一个gigaseal,第三个应用吸入脉冲实现磨合。patch-clamping过程期间,Imagepatcher软件运行这些自主控制回路。基于MATLAB接口允许研究人员管理和监控程序(图4)。

第一个控制回路的算法从显微镜获得图像,分析识别单元,计算细胞之间的偏移量和吸管,并发送命令显微操纵器将吸管接近细胞。重复这些步骤直到吸管已达到其目标,暗示的电阻测量的突然改变吸管小费。

在这个循环中,我调用图像处理函数来分析图像生成的显微镜。首先,我使用一个2 d光子维纳滤波器消除噪声,它表现为高强度图像中斑点。接下来,我申请一个阈值函数来生成图像的二进制版本,隔离了荧光标记细胞。然后执行对二进制图像形态学操作来确定 重心 rna也许点细胞内的边界与吸管,我的目标。我使用一个类似的过程,在循环开始之前,孤立的吸管形象和识别提示(图5)。这个技巧是用来计算的初始位置提示位置后内吸管动作循环。在计算单元形心之间的抵消和吸管提示在三维空间中,该算法生成的显微操纵器命令需要移动移液管和发送命令到显微操纵器通过串行接口。

一旦吸移管到细胞,Imagepatcher进入压力控制回路。这里,吸管的算法产生的压力通过使用MATLAB和数据采集工具箱™产生模拟信号设置的三个电子压力调节器和数字信号的四个电子阀门。算法动态改变压力,直到电阻测量顶端达到1 GΩ。压力控制算法采用启发式,加快形成gigaseal-for示例中,如果测量电阻远低于1 GΩ和缓慢上升,该算法显著增加吸入,而如果是稳步上升的阻力,它维护现有的压力和等待gigaseal形式。

第三个和最后一个控制回路用于进入细胞膜。最初,Imagepatcher开始这个循环后自动gigaseal实现,但同事们指出,一些研究人员更喜欢录音之前闯入(即。cell-attached录音)。Cell-attached录音不提供相同级别的信息作为全细胞记录(例如,亚阈值的活动),但一些研究需要记录从一个完整的细胞。来满足这个要求,Imagepatcher配置为暂停并等待操作员确认之前的第三个控制回路。

开始磨合,Imagepatcher一系列适用于吸入脉冲压力越来越大,而再次监测电阻测量在吸管的小费。细胞膜破裂时,测量电阻下降超过1 GΩ几百兆欧姆。当磨合,Imagepatcher停止吸入,研究人员就可以开始录音了。 

最初的结果和改进计划

Imagepatcher匹配的第一个版本或略超过成功率由经验丰富的研究人员报道,实现全细胞配置约20 - 22%的时间。10分钟左右,Imagepatcher需要完成patch-clamping过程由这些人员与所需的时间。录音的长度后自动patch-clamping(平均约15分钟)和他们的质量可比的录音后手动patch-clamping程序,表明Imagepatcher不损害细胞比手动补丁——夹紧过程。最重要的是,Imagepatcher提供了一致性和一致性,不能被手动匹配方法,使更多的人员执行过程可靠。事实上,全球七个实验室使用Imagepatcher已经表示有兴趣。

我计划实施改进,将改进的速度和成功率Imagepatcher利用硬件的能力来执行技术,不能手动执行,如吸入的精确应用脉冲模式。