加速发展新的单分子定位和跟踪技术

单分子定位和跟踪(SMLT)是一种描述单个分子运动的技术，已有30多年的历史。通过测量扩散系数并将分子运动表征为随机的、定向的或受约束的，科学家可以研究活细胞中的亚细胞动力学，包括病毒感染、基因转录和细胞表面受体的行为。

尽管SMLT的历史相对较长，应用也很多，但它有几个缺点。例如，它不能告诉我们分子的形状和大小，也不能告诉我们这些形状和大小如何随时间变化。此外，SMLT效率较低，有时由于分子的失焦运动导致统计误差而无法工作。

我在阿卜杜拉国王科技大学(KAUST)的研究小组开发了一种测量单分子扩散的方法，不存在这些限制。而不是从分子轨迹的空间和时间成分来量化扩散，就像传统的SMLT，我们的MATLAB^®基于的方法通过分析分子在空间中所占的累积面积(CA)随时间的增加来量化扩散(图1)。通过比较传统SMLT技术计算的扩散系数的统计分布和新的CA方法计算的扩散系数的统计分布，我们用MATLAB验证了我们的方法。CA方法优于传统的SMLT方法，可重复测量我们测试的DNA分子的扩散动力学。

我们工作的核心-图像处理和对显微镜图像进行拟合和数学计算-是使用MATLAB完成的。MATLAB提供了三个关键优势，使其非常适合我们的研究。首先，它很容易学。尽管我的专业背景是药剂学，而不是编程，但我对MATLAB的掌握程度足以让我在短短一个月内完成这项研究。我要用6倍的时间才能掌握类似的语言，比如c++或Java^®．其次，KAUST拥有学术人员总数(TAH)许可证，这使得KAUST的研究人员可以轻松地在校园的任何地方访问MATLAB及其附加工具箱中的大量功能和函数。第三，SMLT和CA方法计算量大，一次实验需要数十万个高斯拟合。并行计算工具箱™和MATLAB并行服务器™使我能够加速这些方法，并缩短多个实验的处理时间，从几天到几个小时(参见侧栏）.

创建模拟粒子、纳米球和DNA分子的图像序列

SMLT和CA方法都涉及分析一系列图像帧，通常从显微镜捕获，每个帧中都有一个或几个分子可见。我们应用CA方法来描述粒子的运动，并在三种不同的情况下计算扩散系数。第一种方法使用模拟数据创建图像序列。第二组和第三组使用我们实验室定制的宽视场epifluorescence显微镜获得的图像序列。

我们设计了第一个场景来验证CA方法。在MATLAB中，我们使用1.0、1.5和2.0微米2/秒的预定扩散系数在2D空间中生成粒子的随机行走轨迹。对于随机行走的每一步，我们使用粒子的x和y位置来定义图像序列中单帧中5像素交叉的中心(图2)。然后我们使用CA方法计算模拟粒子的扩散系数，并验证了结果(分别为1.10,1.51和1.98 micrometers2/sec)与我们的预定值一致。

在第二种和第三种情况下，我们追踪了直径约0.2微米的黄色荧光聚合物纳米球和不同长度和拓扑形式的双链DNA分子。我们以每6.4毫秒1帧的速度捕获纳米球和分子的图像。我们使用SMLT和CA方法处理这些图像。

实现CA方法

在MATLAB中，我们开发了一种算法来实现CA方法(图3)。使用通过模拟生成或在实验室捕获的数千个512 x 512像素帧的序列，该算法首先调用Image Processing Toolbox™函数，根据初始阈值去除背景。该算法通过使用曲线拟合工具箱™用高斯函数拟合帧中所有像素强度的频率分布来计算该阈值。

在从帧中去除噪声像素后，算法逐渐增加背景阈值，直到只剩下5个像素，定义该帧中分子所占据的空间面积。

当序列中的所有帧处理完毕后，算法将它们叠加，得到分子在每一帧中所占据的累积面积，然后减去相邻帧的累积面积，得到累积面积差值，用于计算扩散系数。

用并行和分布式计算加速进程

由于一个实验需要大约20万个高斯配件，我们很快发现在单个处理器上运行实验花费的时间太长，不太实际。为了缩短处理时间，我们使用并行计算工具箱在多核工作站上执行计算。使用四核的实验需要大约3个小时，而使用16核的实验只需45到50分钟。

当然，我们经常需要运行许多模拟和实验来获得有效的统计结果。为了进一步加快进程，我们开始使用MATLAB并行服务器在KAUST的IT研究计算集群上一次运行512个核上的作业。这些集群为用户提供了超过10000个内核。使用这个设置，我们可以在15分钟内完成一组在多核机器上花费24小时的实验。

可视化和解释结果

我们目前正在解释模拟和实验的结果。在MATLAB中，我们将实验结果可视化，以便更好地了解ca方法与SMLT相比的表现。

为了在相同的实验数据上与传统的SMLT方法进行比较，我们在MATLAB中实现了SMLT。我们的SMLT算法在每一帧像素上应用二维高斯拟合来确定分子质心的位置。在对每一帧重复这一过程后，该算法将跨帧的质心连接起来以创建一个轨迹，然后对轨迹进行均方位移分析以表征分子的运动(图4)。

我们使用MATLAB中实现的动态时间扭曲(DTW)技术来测量SMLT和ca方法结果之间的相似性和差异。早期的结果表明，ca方法除了能够为科学家提供分子大小和构象变化频率的信息外，还具有较小的统计误差。